Prueba de detección de COVID-19 mediante el uso de saliva orofaríngea al azar

Resumen

El diagnóstico de cualquier enfermedad infecciosa es vital para el tratamiento oportuno y para prevenir la diseminación. Las pruebas RT-qPCR para la detección del SARS-CoV-2, el agente causante del COVID-19, son ideales en un entorno hospitalario. Sin embargo, las pruebas masivas requieren pruebas más baratas y sencillas, especialmente en entornos que carecen de maquinaria sofisticada. El método de diagnóstico actual más habitual se basa en la recogida de muestras nasofaríngeas, la extracción de ARN y la RT-qPCR para la amplificación y detección de ácidos nucleicos virales.

Aquí demostramos que las muestras obtenidas a partir de hisopos nasofaríngeos en VTM y en saliva pueden utilizarse con o sin purificación de ARN en un ensayo basado en la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), con una sensibilidad del 60-93% para la detección del SARS-CoV-2 en comparación con las pruebas RT-qPCR estándar. Una serie de modificaciones sencillas a los métodos estándar de RT-LAMP publicados para estabilizar las fluctuaciones de pH debidas a la acidez salival dieron lugar a una mejora significativa de la fiabilidad, abriendo nuevas vías para la realización de pruebas eficientes y de bajo coste de la infección por COVID-19.

Custom Antibody titration by ELISA up to 2 rabbits and 1 bleed
Alpha Diagnostics
Frit Kit
Next Advance
Column Packing Kit
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Introducción

Los años 2019 a 2021 serán recordados por la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). El número de víctimas de la enfermedad en el mundo ha superado los 142,5 millones de casos y más de 3 millones de muertes y no parece haber disminuido su ritmo de contagio en los últimos meses. Sólo en EE.UU. se han registrado más de 31,7 millones de casos y más de quinientos sesenta mil muertes. La tasa de letalidad en EE.UU. es de alrededor del 1,8% (número de muertes/número de casos confirmados), en países en desarrollo como Brasil, la tasa de letalidad es de alrededor del 2,7%, mientras que en México llega al 9,2%.

Custom Antibody titration by ELISA up to 2 rabbits and 1 bleed
ELISA-1
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Las técnicas de diagnóstico sencillas, baratas y precisas son de suma importancia para aislar a los individuos infectados y frenar la transmisión de la enfermedad, evitar la sobresaturación de los centros sanitarios y atenuar la morbilidad y la mortalidad. Por ello, la comunidad científica ha avanzado con notable rapidez en el desarrollo de herramientas de diagnóstico, ya sea para su uso en centros sanitarios especializados o en puestos comunitarios de atención.

Las pruebas para detectar el SARS-CoV-2, el agente causal del COVID-19, suelen basarse en la detección de proteínas (antígenos virales o anticuerpos del huésped) o de ácidos nucleicos virales. Las pruebas de detección de anticuerpos indican si la persona ha sido infectada por el SARS-CoV-2 y ha generado anticuerpos IgG y/o IgM. Estas pruebas se realizan en suero o plasma sanguíneo y, aunque son baratas y fáciles de administrar, no indican si la infección está activa, ya que pueden pasar de 1 a 3 semanas tras la exposición para que se produzcan suficientes anticuerpos para ser detectados.

100 BP DNA LADDER, 500UL PER KIT
M-DNA-100BP CORNING
1 KB DNA LADDER, 500UL PER KIT
M-DNA-1KB CORNING
DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library
L1033-.1 ApexBio
DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library
L1033-.25 ApexBio
DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library
L1033-5 ApexBio

Los títulos de anticuerpos varían en los pacientes; los que presentan síntomas más leves o son asintomáticos suelen tener títulos de anticuerpos relativamente bajos que desaparecen unas semanas después de la infección, mientras que los pacientes con síntomas más graves suelen presentar títulos de anticuerpos más altos que pueden detectarse dos o tres meses después de la infección. Cuando se realiza en la fase correcta de la infección, la sensibilidad de la prueba de anticuerpos puede ser de alrededor del 90% y los resultados pueden obtenerse en tan sólo 15 minutos.

Las pruebas basadas en la carga viral detectan los virus presentes en el huésped y pueden estar basadas en antígenos, detectando fragmentos específicos de proteínas virales, o en la PCR, amplificando el ARN viral. A diferencia de las pruebas serológicas, estas pruebas indican si el paciente tiene una infección activa independientemente de su respuesta inmunitaria. Las pruebas inmunocromatográficas de antígenos pueden dar resultados en 15 minutos. Sin embargo, los resultados comunicados oscilan entre el 100% (basado en 7 muestras) y el 32% de precisión (basado en 106 muestras RT-qPCR positivas) .

Protein A protein
Fitzgerald
pLDH Protein Protein
Abbexa
pLDH Protein Protein
Abbexa

El método actual recomendado por la FDA para determinar las infecciones por COVID-19 se basa en la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR). Este método de detección del virus amplifica secuencias específicas del ARN del SARS-CoV-2 que se encuentra en una muestra determinada. Dependiendo del fabricante, de la naturaleza y el volumen de la muestra y de los oligonucleótidos, las pruebas de RT-qPCR pueden detectar tan sólo 242 copias/mL de ARN del SRAS-CoV-2 o de 1 a 10 equivalentes de copias genómicas por reacción.

Hay tres problemas relacionados con la RT-qPCR estándar que la hacen menos que ideal para las pruebas a gran escala. En primer lugar, las pruebas suelen realizarse utilizando muestras nasofaríngeas (NP) suspendidas en un medio de transporte de virus (VTM). Como el método de muestreo es desagradable, requiere hisopos especializados y es difícil de autoadministrar, se ha considerado el muestreo de saliva como una fuente alternativa de muestras . En segundo lugar, la extracción del ARN de las muestras es tediosa y añade un tiempo y un gasto considerables al ensayo. Y en tercer lugar, las pruebas RT-qPCR generalmente requieren kits caros y acceso a un termociclador caro que puede no estar disponible en todos los entornos. Hemos tratado de resolver estos tres problemas para desarrollar una plataforma de pruebas más rápida, menos costosa y más accesible para la detección del ARN del SARS-CoV-2 en pacientes.

Paraffin Wax Dispenser
Scientific Laboratory Supplies
Paraffin wax, granular (56 - 60)
Glentham Life Sciences
Paraffin wax, granular (56 - 60)
Glentham Life Sciences
MagSi-WAX
AMSBIO
MagSi-WAX
AMSBIO

Metodología
Muestras de pacientes

Las muestras residuales se conservaron de forma desidentificada, sin relación con los identificadores de los pacientes. Estas muestras residuales de hisopos de diagnóstico de los pacientes del Centro Oncológico Fox Chase, el Hospital Jeanes y el Hospital de la Universidad de Temple se almacenaron en VTM a -80 °C después de las pruebas en el Laboratorio de Diagnóstico Molecular de Fox Chase. Las muestras de saliva se obtuvieron de voluntarios adultos sanos que dieron su consentimiento y se almacenaron a -80 °C después de las mediciones de pH y las pruebas de RT-LAMP.

MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit
Bioingentech
MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit
Bioingentech
MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit
Bioingentech
MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit
Bioingentech
ranavirus PCR kit
Bioingentech

Panbio Covid 19 Test Kit

La prueba de diagnóstico del SARS-CoV-2 utilizada en el Laboratorio de Diagnóstico Molecular de Fox Chase extrae el ARN de muestras nasofaríngeas de pacientes en VTM utilizando un kit Qiagen QIAamp Viral o un kit Perkin Elmer chemagen Viral 300, seguido de una RT-qPCR en un instrumento ABI QuantStudio 12K Flex utilizando el kit ThermoFisher TaqPath COVID-19 Combo, que puede detectar al menos 10 copias del virus por reacción. El SARS-CoV-2 es estable y puede ser detectado por RT-qPCR y LAMP tanto en VTM como en saliva durante 7 a 25 días en un rango de 4 a 30°C.

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ELISA-1 Alpha Diagnostics
Beta2-Microglobulin ELISA kit ELISA Kit
LF-EK60047 Abfrontier
Chicken thrombomodulin,TM ELISA KIT ELISA
QY-E80092 Qayee Biotechnology
Oxycodone ELISA
EK7130 BosterBio
Amphiphysin ELISA
LF-EK0189 Abfrontier

Protocolos para muestras nasofaríngeas (NP) y de saliva
Ensayo directo

Se añadió 100X de tampón de inactivación (0,5 M de TCEP-HCl, 0,1 M de EDTA< pH 8, más 1,15 N de NaOH, 0,1% μL de NP-10 y 5% de SDS en agua MQ, pH 8 con NaOH) para tratar las muestras mediante el ensayo directo. Se realizaron curvas de detección límite utilizando diferentes diluciones del control de ARN TaqPath COVID-19, A47814 ThermoFisher Scientific. Las muestras fueron inmediatamente agitadas en vórtex, centrifugadas a pulso, incubadas a 95°C durante 5 minutos y centrifugadas 30s a 5.000 xg para precipitar las proteínas en las muestras de VTM y saliva. La adición de detergentes y el calentamiento aseguran la muerte del virus. Se añadió 1,0 μL de este sobrenadante a una reacción de RT-LAMP de 10 μL previamente preparada.

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ELISA-1 Alpha Diagnostics
Beta2-Microglobulin ELISA kit ELISA Kit
LF-EK60047 Abfrontier

Ensayo de precipitación de ARN.

Los nucleótidos presentes en la muestra se precipitaron utilizando perlas de sílice . Brevemente, las muestras de NP en VTM o saliva se añadieron a un tubo Eppendorf que contenía una solución con tampón de inactivación 100X, y RNAsecure (25X) . La adición del RNAsecure (mezcla de Beta-mercaptoetanol), desnaturaliza irreversiblemente los ARNs mediante la reducción de los enlaces disulfuro, protegiendo así el ARN. Para las muestras de saliva, se añadió un microlitro de proteinasa K (MEB 8107S) en dilución 1:10 por cada 250 μL de reacción. Las muestras se agitaron en vórtex, se centrifugaron por impulsos, se incubaron a 55° durante 15 minutos y a 95°C durante 5 minutos, y se centrifugaron 30s a 5.000 xg para precipitar la proteína no deseada. Las muestras tratadas se transfirieron a un nuevo tubo, teniendo cuidado de evitar el arrastre del precipitado.

Custom development of ELISAs for other species or antibody isotypes not listed in the catalog. Custom testing of samples for IgG/IgM/IgA or total (IgG+IgM+IgA)
Alpha Diagnostics
Alpha-bungarotoxin, CF405s
Cusabio
Alpha-bungarotoxin, CF405s
Biotium
Alpha-bungarotoxin, CF680r
Biotium

Se añadieron 0,35 mL de solución de unión de ARN (6M de NaI, 2% de Tritón-100 y 10 mM de HCl) y 5 μL de leche de vidrio/gel de sílice 1:1 p/v en 10 mM de Tris-HCl pH 8 y 1 mM de EDTA pH 8, por cada 0,75 mL de muestra y se dejaron a temperatura ambiente durante 15-20 minutos agitando cuidadosamente por inversión cada dos minutos. Las muestras se centrifugaron 1 minuto a máxima velocidad en una microcentrífuga. El sobrenadante se desechó en lejía al 10% y el pellet se lavó con EtOH al 80% sin desalojarlo. Las muestras se centrifugaron durante 1 minuto a 13.000 xg, luego se descartó el etanol y los tubos se secaron a 55°C durante un minuto. Las muestras se resuspendieron en 9 μL de tampón de inactivación 1x precalentado y se utilizaron para el ensayo RT-LAMP o se conservaron a -80°C. Se añadieron 3 μL de esta muestra directamente a una reacción de RT-LAMP previamente preparada de 10 μL.

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000-CUS Alpha Diagnostics
Alpha-bungarotoxin, CF405s
00002 Cusabio
Alpha-bungarotoxin, CF405s
00002-100ug Biotium
Alpha-bungarotoxin, CF680r
9-00003 Biotium
Alpha-bungarotoxin, CF680r
9-00003 Biotium

Reacción de RT-LAMP

Las reacciones se prepararon de acuerdo con el WarmStart LAMP Kit (NEB). Primero se añadió la mezcla maestra de LAMP a los tubos de PCR para evitar la contaminación. Se utilizaron dos o tres juegos de oligos para cada ensayo: NEB Gene N-A, HMS Assay 1e, NEB oligonucleótidos orf1a-A, y un control de actina (ACTB) para las muestras de saliva. Se diseñaron cebadores para genes específicos del genoma del SARS-CoV-2.

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000-CUS Alpha Diagnostics
Alpha-bungarotoxin, CF405s
00002 Cusabio
Alpha-bungarotoxin, CF405s
00002-100ug Biotium
Alpha-bungarotoxin, CF680r
9-00003 Biotium

Fuentes :

  1. NCBI
  2. Gentaur

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